本发明涉及地霉菌及其用于原位酶解纤维素的方法,属于微生物技术领域。涉及一株新从土壤中分离的耐受氧化吗啉-N-氧化物(NMMO)的纤维素酶产生菌地霉菌属,Galactomycessp.CCZU11-1,保藏号为CGMCCNo.5561。其代谢的纤维素酶可耐受NMMO,在反应体系中含有25%(v/v)的NMMO仍表现出较高的活性,可实现原位高效酶解纤维素,具有过程经济、三废少等优点。本发明工艺简单,与现有的NMMO处理纤维素后再生酶解的“两步法”相比,具有效率高、过程经济、三废少等优点。
1.地霉(Galactomycesxa0sp.)xa0CCZU11-1,保藏号为CGMCCxa0No.xa05561。
2.利用权利要求1所述的地霉原位酶解纤维素的方法,其特征在于按照如下步骤进行:(1)菌株的培养:摇瓶培养:将上述地霉xa0Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1采用本领域常规的方法,在摇瓶培养基中进行扩增培养120~192xa0h,培养温度为25~35°C;xa0(2)纤维素酶冻干粉制备:将上述培养获得的发酵液经过离心10,000×g,xa010xa0min除去菌体,聚偏氟乙烯超滤膜,分子量1-10万,超滤之后获得活性粗蛋白,活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉;(3)冻干纤维素酶粉原位酶解纤维素原料:分别用质量浓度为85%的NMMO在85°C下对微晶纤维素或甘蔗渣进行溶解预处理35min后,加入pH=5.0乙酸-乙酸钠缓冲液50xa0mM形成NMMO/溶剂体系,NMMO含量占NMMO/溶剂体系体积的25%,然后用浓度为1-10xa0g/L上述纤维素酶进行纤维素原料的原位酶解,在50°C和160xa0rpm的恒温摇床上振荡反应,即可达到酶解纤维素的目的。
3.根据权利要求2所述的地霉原位酶解纤维素的方法,其特征在于其中步骤(1)中所述的培养基组分和含量如下:(NH₄)₂SO₄xa04-10xa0g/L,KH₂PO₄xa02-8xa0g/L,MgSO₄·7H₂Oxa00.1-0.8xa0g/L,CaCl₂·2H₂Oxa00.1-0.6xa0g/L,Tween-80xa00.2-1.2xa0g/L,羧甲基纤维素钠10-20xa0g/L,甘蔗渣xa010-20xa0g/L。
4.根据权利要求2所述的地霉原位酶解纤维素的方法,其特征在于其中步骤(3)中所述的纤维素酶的浓度为2.5xa0g/L。技术领域
本发明公开了一株新近从土壤中分离的纤维素酶产生菌地霉菌Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1(保藏号为CGMCCxa0No.xa05561)的培养及其在NMMO/溶剂体系高效原位酶解纤维素原料的方法,属于微生物技术领域。
背景技术
随着煤炭、石油等不可再生资源的日益匮乏以及各国对环境污染问题的日益关注和重视,由生物质纤维素等可再生资源转化为高热值能源、新型工业原料、精细化学品等,已经不可避免地成为今后工业发展的趋势。据美国能源部预计,纤维素等可再生资源将大规模用于工业生产,到2020年来自纤维素等可再生资源的化学产品将占市场份额的10%,到2050年其比例将达到50%。纤维素结构复杂、具有较高的结晶度、纤维素内部存在大量的结晶结构以及分子间与分子内氢键,导致溶剂和反应试剂对纤维素的可及度很低,这已成为制约纤维素资源化利用的瓶颈。为此,各国科学家致力于开发新型的纤维素溶剂,主要有四氧二氮/二甲基甲酰胺(N₂O₄/DMF)、氯化锂/二甲基乙酰胺(LiCl/DMAc)、二甲基亚砜/四乙基氯化氨体系(DMSO/TEAC)。近年来环胺氧化物尤其是氧化吗啉-N-氧化物(NMMO)被认为是相对比较有前途的有机溶剂用于纤维素的溶解。NMMO是一种脂肪族的环状叔胺氧化物,N-O键的极性很强,氧原子上的电子云密度很高,N-O之间形成了配价键。NMMO与纤维素不生成纤维素衍生物。由于NMMO中N-O键的极性很强,易使纤维素酶失活。然而,目前对耐受NMMO的纤维素酶产生菌少有报道,因此筛选到耐受NMMO的纤维素酶新酶源是当务之急。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种耐NMMO纤维素酶产生菌地霉菌及其纤维素酶原位酶解纤维素的方法,以实现纤维素原料的高效酶解。本发明所述的地霉xa0Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1,属于地霉属,从常州大学校区附近的土壤中筛选获得,该菌株已于2011年12月8日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCCxa0No.xa05561。本发明的地霉菌用于原位酶解纤维素的方法,按照如下步骤进行:(1)菌株的培养:摇瓶培养:将上述地霉xa0Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1采用本领域常规的方法,在摇瓶培养基中进行扩增培养120~192xa0h,培养温度为25~35xa0°C;xa0(2)纤维素酶冻干粉制备:将上述培养获得的发酵液经过离心(10,000×g,xa010xa0min)除去菌体,聚偏氟乙烯超滤膜(PVDF100超滤膜,分子量1-10万)超滤之后获得活性粗蛋白,活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉;(3)冻干纤维素酶粉原位酶解纤维素原料:分别用质量浓度为85%的氧化吗啉-N-氧化物在85xa0°C下对微晶纤维素或甘蔗渣进行溶解预处理35min后,加入pH=5.0乙酸-乙酸钠缓冲液(50xa0mM)形成NMMO/溶剂体系,NMMO含量占NMMO/溶剂体系体积的25%,然后用浓度为1-10xa0g/L上述纤维素酶进行纤维素原料的原位酶解,在50xa0°C和160xa0rpm的恒温摇床上振荡反应,即可达到酶解纤维素的目的。其中步骤(1)中所述的培养基组分和含量如下:(NH₄)₂SO₄xa04-10xa0g/L,KH₂PO₄xa02-8xa0g/L,MgSO₄·7H₂Oxa00.1-0.8xa0g/L,CaCl₂·2H₂Oxa00.1-0.6xa0g/L,Tween-80(聚氧乙烯失水山梨醇硬脂酸酯)xa00.2-1.2xa0g/L,CMC-Naxa0(羧甲基纤维素钠)10-20xa0g/L,甘蔗渣xa010-20xa0g/L。其中步骤(3)中所述的纤维素酶的浓度优选2.5xa0g/L。本发明的有益效果:本发明的Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1纤维素酶可耐受NMMO,在反应体系中含有25%(体积比)的NMMO仍表现出较高的活性,可实现原位高效酶解纤维素,具有过程经济、三废少等优点。
附图说明
图1xa0酶解纤维素及甘蔗渣的进程曲线;?未处理的纤维素;?处理的纤维素;?未处理的甘蔗渣;▲处理的甘蔗渣。
具体实施方式
本发明发明人从常州大学校区附近的土壤中,经初筛、复筛及分离纯化得到一株纤维素酶菌株,经过ITS(Internalxa0Transcribedxa0Spacer,内转录间隔区)鉴定,该菌株为地霉Galactomycesxa0sp.,编号为Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1。该菌株已于2011年12月8日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC),保藏号为CGMCCxa0No.xa05561。上述菌株的筛选过程如下:采集了不同环境条件下480份土壤样品,利用甘蔗渣为唯一碳源进行两轮固体富集培养,筛选纤维素酶产生菌。利用NMMO存在条件下通过反复筛选,分离得到一株耐受NMMO的高活力纤维素酶产生菌。理化性质如下:表xa01xa0CCZU11-1菌株理化特征特征结果菌落淡绿,平铺,表面干燥菌丝伸展菌丝平行孢子链集串分枝分生孢子节孢子,卵圆形(4.9-12.1)×(3.7-8.2)μm本发明中纤维素酶活力单位定义:一个酶活单位(U)定义为在上述条件下,在50xa0°C条件下1xa0min水解CMC或滤纸(1.0×6.0xa0cm)产生1xa0μmol还原糖(以葡萄糖为准)所需的酶量。还原糖的含量用3,5-二硝基水杨酸(DNS)进行分析。实施例1NMMO存在条件下纤维素酶的发酵:在1xa0L摇瓶中装入250xa0mL培养基((NH₄)₂SO₄xa010xa0g/L,KH₂PO₄xa08xa0g/L,MgSO₄·7H₂Oxa00.8xa0g/L,CaCl₂·2H₂Oxa00.6xa0g/L,Tween-80xa01.2xa0g/L,CMC-Naxa020xa0g/L,甘蔗渣xa020xa0g/L),在35xa0°C下160xa0rpm摇床上预培养Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1xa048xa0h。加入10%xa0(w/w)的NMMO,继续培养到192xa0h。获得的纤维素酶发酵液的滤纸酶活(FPA)和内切酶活(CMCase)分别为0.45xa0U/mg和0.63xa0U/mg。实施例2(1)Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1的培养:在1xa0L摇瓶中装入250xa0mL培养基((NH₄)₂SO₄xa04xa0g/L,KH₂PO₄xa02xa0g/L,MgSO₄·7H₂Oxa00.1xa0g/L,CaCl₂·2H₂Oxa00.1xa0g/L,Tween-80xa00.2xa0g/L,CMC-Naxa010xa0g/L,甘蔗渣xa010xa0g/L),在25xa0°C下160xa0rpm摇床上培养Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1xa0120xa0h。获得的纤维素酶发酵液的滤纸酶活(FPA)和内切酶活(CMCase)分别为0.48xa0U/mg和0.76xa0U/mg。获得的发酵液利用PVDF100超滤膜超滤之后获得活性粗蛋白,活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉。(2)NMMO/溶剂体系酶解纤维素原料:分别用含量为85%xa0(w/w)的NMMO在85xa0°C下对2.0xa0g/L的甘蔗渣和微晶纤维素进行溶解预处理35xa0min,加入pH=5.0乙酸-乙酸钠缓冲液(50xa0mM)形成NMMO/溶剂体系,NMMO含量占NMMO/溶剂体系体积的25%,然后用浓度为2.5xa0g/L的上述纤维素酶冻干粉(Galactomycesxa0sp.xa0CCZU11-1纤维素酶冻干粉)进行酶解,在50xa0°C和160xa0rpm的恒温摇床上振荡反应22.5xa0h,还原糖的含量用DNS法进行分析。结果如图1所示。